Cell Research：清華大學研發新型非病毒CRISPR/Cas9遞送系統 能在體內進行靶向基因治療

　　2017年1月24日，清華大學譚旭研究組與美國俄亥俄州立大學董一洲研究組合作在《Cell Research》上發表了題為《A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutic gene targeting in vivo》，在國際上首先研發出一種新型CRISPR/Cas9遞送系統，其能夠在體內遞送CRISPR/Cas9至肝臟，并在單鏈引導RNA（sgRNA)的引導下靶向切割外源或內源致病基因從而達到治療肝病的目的。該種新型遞送系統為CRISPR/Cas9這一強有力的基因編輯工具，在臨床上的實際應用開辟了新途徑。

　　自上個世紀90年代以來，基因治療逐漸興起，其通過補償基因缺陷或修正異常致病基因從而達到治療的目的。CRISPR/Cas9是在細菌中發現的一種DNA剪編輯系統，由于其高效特異的DNA剪切和編輯能力在科研領域已經得到廣泛應用，而在臨床治療中其應用前景也非常值得期待。已有的CRISPR/Cas9體內輸送是通過運用腺病毒表達體系來表達Cas9和guide RNA，如同腺病毒在基因治療歷史中的巨大作用一樣，但也存在諸如腺病毒缺乏靶向性，本身免疫源性較高，病毒在體內有一定重組突變機率等問題。而且，腺病毒在細胞內的長期穩定表達Cas9 DNA酶，也有可能帶來長期的毒副作用。

　　基于脂質納米顆粒的核酸輸送系統已經在活體內輸送小RNA，如siRNA上表現出良好的效果。譚旭課題組與董一洲研究組合作研發了一種新型脂質納米顆粒系統，其可以包裹Cas9蛋白的mRNA以及單鏈引導RNA并在活體內有效的輸送至肝臟并進行表達，對特定致病基因進行切割。

　　為測試所研發的新型脂質納米顆粒系統的實際效果，研究組分別選取了以下一個外源性靶點和一個內源性靶點進行測試。選擇的外源性靶點是乙肝病毒（HBV）基因組。全球乙肝病毒感染者約有3.5億人，而在中國更是一個嚴重的社會問題。乙肝病毒難以徹底清除的主要原因是其基因組以一種共價閉環DNA（covalently closed circular DNA或cccDNA)形式存在，而現有治療手段均無法觸及cccDNA；選擇的內源性靶點是前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9， PCSK9）是當前針對高膽固醇血癥和其它心血管疾病藥物研發的重要靶點。就目前來看，針對PCSK9的藥物主要是抗體類藥物，需要長期多次服用，價格昂貴。上述二者均有希望通過編輯其基因序列而達到治療的目的，故研究組選取此二者為對象，測試這種新型的藥物遞送系統。

　　研究發現在細胞水平上，經這種新型脂質納米顆粒（LNP）包裹的Cas9/sgRNA，能夠有效的對細胞中HBV cccDNA和Pcsk9基因進行切割，并有效的降低HBV相關抗原的表達。動物實驗結果表明，這種新型脂質納米顆粒可以有效遞送Cas9/sgRNA輸送至肝臟進行表達，并且尾靜脈注射6小時后Cas9蛋白表達量達到最大，其后逐步降低，24小時后消失。在肝臟內，所遞送的Cas9/sgRNA能對內外源基因序列進行有效的特異性剪切，進而降低相關蛋白的表達量。一次注射能有效降低乙肝病毒表達量50％以上。國際審稿人認為這項工作是本領域激動人心的成果，對CRISPR/Cas9系統未來的臨床轉化研究有重要意義。該研究成果以通訊形式于2017年1月24日在線發表于《Cell Research》上。

　　論文通訊作者為譚旭和董一洲。清華大學生命科學學院博士生蔣超、梅淼，俄亥俄州大學博士后李斌、清華大學醫學院博士生朱修銳為共同第一作者。清華大學生物醫學工程系的郭永課題組也有重要貢獻。該工作得到了科技部重點研發計劃，中組部青年千人計劃，生命科學聯合中心和美國蓋茨基金會的資助。